ES细胞基因靶向服务

动物模型核心通过胚胎干细胞的基因靶向，可产生敲除小鼠、条件敲除小鼠、敲入小鼠等。我们提供全套服务和特别服务，以满足客户的需求。

ES细胞基因靶向服务

对于CRISPR/Cas9修饰不理想的项目，我们还提供ES细胞基因靶向服务，以创建转基因小鼠。基因靶向服务可用于C57BL/6、129P2/Ola和BALB/c背景菌株的ES细胞。基因靶向载体可以由Core生成，也可以由客户端提供。许多基因的靶向载体可能从敲除小鼠联合体(KOMP/EUCOMM/NorCOMM)中获得。有针对性的胚胎干细胞对于许多老鼠基因来说也可从KOMP/EUCOMM获得，使条件(floxed)等位基因的生产比完全靶向项目的时间更短。当可用时，Core可以执行KOMP/EUCOMM细胞的验证和微注射。

目标矢量设计:一般考虑因素和客户/设施责任

我们强烈建议让核心提供载体构建和ES细胞筛选，以最有效的项目进展。

想要构建自己的靶向载体的客户应在开始构建靶向载体和阳性对照质粒之前与设施主管咨询。同源的“短”臂通常应该至少1.5 kb长。用于PCR筛查的阳性对照质粒将包含整个基因组DNA片段，包括同源性短臂，但稍长一些，以便用于胚胎干细胞筛查的靶向位点特异性引物集。长臂可达10kb长，但长度为5-10 kb是可以接受的，以合理的频率瞄准大多数位点。在构造目标矢量时，应考虑同源臂的来源。在某些情况下，可能需要等基因DNA有效靶向。从C57BL/6 DNA构建的BAC克隆可通过CHORI用于载体靶向C57BL/6 ES细胞。BMQ BAC克隆可从CHORI获得129株株DNA来源，用于靶向E14 ES细胞(株129P2/Ola)的载体。C57BL/6或E14 ES细胞DNA也可从PCR克隆设备中获得。还应该考虑删除大小。 Deletions of 10 kb or less are easily obtained following positive-negative selection.

对于大于10kb的缺失或间隔较大的插入，我们建议在胚胎或ES细胞中使用CRISPR/ cas9介导的靶向。

提交针对DNA

提交基因靶向载体的客户应遵循以下指导方针:靶向DNA应在用限制性内切酶线性化后提供给工厂。客户应提供至少100µg的线性化靶向载体和显示DNA已线性化的凝胶图片。如果可能，内切酶应热灭活(向内切酶供应商咨询有关热灭活的具体信息)。在电穿孔之前，核心将净化和沉淀DNA。

ES细胞靶向和筛选

对于由核心产生的载体，核心将提供所有的ES细胞筛选，包括阳性对照开发，PCR和Southern blot检测开发，以及ES细胞筛选。客户也可以要求由客户提供的或从KOMP/EUCOMM购买的ES细胞筛查服务。

以下说明适用于客户提供自己的ES细胞筛查:客户必须在项目启动前证明有能力通过PCR和Southern杂交检测检测目标位点。原代ES细胞的筛选通常是通过PCR，使用同源臂外的一个引物和引入突变的一个引物(如neo引物)。在PCR反应中，将10 fg的阳性对照质粒与5µl的ES裂解物(可从核心获得)混合，以建立PCR筛。该设施将为检测开发提供ES细胞裂解物DNA。希望通过小型southern blot进行初级筛选的客户可以要求提取DNA的细胞板。Core可根据要求提供PCR和Southern blot检测ES细胞。通过PCR检测目标位点阳性的ES细胞必须通过Southern杂交试验确认。扩增pcr阳性克隆，冷冻在液氮中，大量生长用于Southern杂交，以确定正确的靶向ES克隆。该机构将为此目的向客户提供纯化的DNA。经Southern blot检测阳性的克隆可以进行囊胚微注射。 The facility is obligated to provide the client with up to four 96-well plates to screen by PCR. In signing the “Service Request Form”, the client accepts these conditions and agrees to pay for services whether or not a targeted ES cell line has been obtained. The client is not liable for negative results due to failures on the part of the facility (such as clone loss due to incubator malfunction). However, clients are responsible for paying for negative experiments due to errors on their part (such as providing the wrong targeting DNA). If recombinant ES cells have not been obtained following 2 rounds of electroporation, selection and screening, it is advisable to meet with the facility director to discuss options. The frequency of PCR-positive clones being correctly targeted by Southerns typically ranges from 50 to 100%. The facility can provide ES cell DNA to the client for them to establish their Southern hybridization assay.

产生传输嵌合体

在任何动物工作开始之前，包括靶向胚胎干细胞的囊胚微注射，客户必须向设施提供从其机构动物福利委员会批准的使用活体脊椎动物申请的IACUC编号。这个数字保证实验机构所提议的实验已经被批准，并且有适当的动物处理和护理协议。基因靶向小鼠是通过将基因靶向ES细胞微量注射到C57BL/6或C57BL/6白化小鼠囊胚中产生的。胚胎干细胞可以是由客户提供的(例如KOMP/EUCOMM)，也可以是由工厂制造的。那些由客户提供的必须扩展并储存在设施的液氮中，这将产生额外的费用。客户提供的ES细胞在微注射前也必须进行小鼠病原体和支原体污染的筛选。不能保证嵌合体的产生或从设施外制造的靶向胚胎干细胞的传播。在该设施内制造的靶向ES细胞被扩展用于注射，不收取额外费用，并携带至少4个高嵌合体雄性细胞的合格保证，或预期的基因改造的传播，以先发生者为例。这项保证只适用于设施中使用的标准胚胎干细胞。在大约3周龄(断奶)时，所有嵌合体都移交给病人照料，除非有繁殖服务要求。 Animal space must be arranged by the client within their institution to receive the animals. At UNC, animal space can be obtained only by contacting the DLAM office. If mice cannot be moved out of the facility because of a failure to secure cage space in a timely manner, a colony maintenance fee will be charged to the client.

对嵌合体初步育种的建议

将C57BL/6 ES细胞注射到C57BL/6-白化胚泡中，从白色宿主背景上的ES细胞产生黑色皮毛的嵌合体。129P2/Ola ES细胞被注射到C57BL/6囊胚中，黑色宿主背景上的ES细胞产生刺鼠(棕色)皮毛。当胚胎干细胞被植入宿主胚胎时，一些胚胎干细胞会迁移到生殖脊，成为生殖细胞。因为生殖细胞来源于产生皮肤的同一细胞系(原始外胚层)，生殖细胞来源于植入的ES细胞的概率可以大致等同于嵌合的程度。换句话说，ES细胞衍生毛发比例高的嵌合体将目标基因传递给后代的可能性很大。高嵌合体的雌性很少产生，但也可能传播预期的基因改造，应该交配。如果空间不是问题，所有嵌合体都应该与野生型(B6)动物交配。如果空间是一个问题，那么只有40%以上的雄性和80%以上的雌性才应该交配。种系传播可以通过繁殖嵌合体回到宿主囊胚品系来确定。对于注射到C57BL/6-白化胚泡中的C57BL/6 ES细胞，嵌合体通常与C57BL/6-白化母细胞交配。 Black pups indicate germline transmission and should be genotyped for the mutant allele, which should be found in about 50% of black pups. White pups are derived from the host blastocyst. For 129P2/Ola ES cells injected into C57BL/6 blastocysts, chimeras are typically mated to C57BL/6 females. Agouti pups indicate germline transmission and should be genotyped for the mutant allele, which should be found in about 50% of agouti pups. Black pups are derived from the host blastocyst. We recommend that selectable marker cassettes be removed to avoid the risk of their contributing to mutant allele phenotypes. Most targeting vectors have the selection cassette (usually a PGK-promoter and neomcyin resistance gene) flanked by FRT sites to allow Flp-mediated removal. Chimeras or F1 animals can be mated to Flpe mice and PCR screening can be used to detect animals with the cassette removed. These animals are then backcrossed and pups screened for removal of the Flpe transgene.

扩展育种选择

有几种育种选择可以采用。选择的选项可能是关键的，因为用于遗传研究的各种小鼠品系之间有许多表型差异，因此客户有必要熟悉品系差异，因为它们与他们的基因和预期表型相关。

A.建立等基因菌株。如果在基因或预期表现型中没有已知的差异，最好的选择是创建一个等基因小鼠系，以避免混合基因型可能对表现型的潜在影响。产生等基因小鼠系的唯一方法是将传播嵌合体与用于制造嵌合体的ES细胞来源相同的品系配对(例如，品系129/Ola)。一种常见的方法是首先将嵌合体与菌株B6配对，以确定哪个嵌合体在传递129个基因组。然而，当与等基因动物杂交时，皮毛颜色不能用于确定种系传播，所有源自嵌合体的后代必须进行基因分型，以确定目标等位基因的传播。这就是为什么通过PCR建立基因分型协议对于减少实验时间和成本变得非常重要。杂合的然后可以杂交产生基因一致的动物，它们之间只在目标位点发生变化。

B.建立同源品系。当怀疑菌株差异影响基因靶向小鼠的表型时，建议通过建立同源小鼠品系来减少菌株相关的变异。这是通过多次回交到有利于表现型的遗传背景上完成的。回交是通过使嵌合体或其刺鼠(+/-)后代与支持表型所需的动物品系(例如Balb/C品系)交配来实现的。这种交配的后代被认为是回交1或N1。在本例中，杂合子N1后代将与野生型Balb/C动物交配产生回交2 (N2)后代。再次，杂合子幼崽将与野生型Balb/C动物交配产生N3后代。选择杂合子动物并与野生型动物交配的循环仍在继续直到9号回交(N9)完成，这时129个基因组中“可以忽略不计”的数量仍然与修饰过的等位基因相关，该菌株被认为是同源的和基因同质的。为了客户的利益，尽快开始回杂交他们的突变小鼠品系。如果在他们的动物中发现了一种有趣的表型，但在为研究生产的第一组纯合子动物中(通常是混合基因型)，其外显率低于100%，审稿人要求在同源品系中重复实验是很正常的。由于反向交叉到N9可能需要一年多的时间，而且很可能有竞争对手制作类似的动物，反向交叉的晚起步可能会造成高调和低调的出版物之间的区别。这是可以发展的e通过使用菌株特异性标记(快速同源)来识别携带所需菌株高比例DNA的回交杂合子后代(如Balb/C)，从而更快地识别同基因菌株。这样，大约6个回交可以产生同源菌株。查尔斯河实验室提供这种服务，但价格昂贵。