光学显微镜样品制备指南
内容
我们经常收到关于固定组织染色方案的请求。虽然我们不能提供涵盖用户带到我们实验室的大量样品的具体方案，但我们确实有一些关于宽视场和共聚焦成像样品制备的一般建议。如果你想为光片成像准备样品，请电子邮件Pablo在开始准备样品之前讨论您的项目。请注意，MSL没有正式认可下面提到的任何产品。
控制
我们经常被问到:“这种染色是真的吗?”这个问题是无法回答的，没有适当的控制成像与实验样本完全相同的设置。以下是我们推荐的一些最常见的控制方法:
自体荧光控制
准备一张不染色的幻灯片，或者不包括任何带有荧光团的试剂(荧光蛋白，注射染料等)。组织和细胞可以有相当大的自身荧光，特别是(但不限于)在光谱的绿色，青色和蓝色区域。在确定实验样品中可见的任何信号是否可归因于自身荧光时，包括此控制可能非常有用。理想情况下，“真实”染色将明显比自身荧光更亮。如果您的实验样品中的染色在强度和分布上与自体荧光对照相似，则您的样品不具有您要染色的东西和/或染色不起作用。
无主要对照
当进行免疫染色时，准备一张不含一抗的载玻片做包括次要的。二抗可以非特异性地与组织结合，或者，如果聚集，导致整个样本的点状染色。包括这种控制有助于确定在实验样品中可见的信号是否可以用二抗的问题来解释。理想情况下，“真正的”染色将明显比无原代对照亮，并且，如果有点状，在无原代对照中不会出现点状(或明显更少和更暗的点状)。如果实验样品中的染色在强度和分布上与无一级对照相似，而无一级对照又比自体荧光对照更亮，则您的样品不具有您要染色的东西和/或您的二抗是非特异性结合和/或聚集。
无目标控制
即使没有非特异性二抗结合，并且自身荧光相对较低，实验样品中的强信号也不能保证您正在查看感兴趣的蛋白质。一抗不一定像宣传的那样具有特异性;最好的控制方法是从样品中去除假定的目标蛋白并在那里进行染色。如果在无目标对照中仍然有明显的染色(假设二抗的自身荧光和非特异性结合不是问题)，那么一抗检测到的是它应该检测到的东西。无目标控制通常非常昂贵，因为它们可能涉及制造(或购买)敲除或敲除细胞系或动物。事实上，它们有时是不可能获得的，因为去除目标蛋白质会杀死被移除的动物或细胞。尽管如此，它们是证明抗体只染色广告上所宣传的东西的唯一方法，除此之外别无其他。
荧光减一对照(用于共定位)
如果您有兴趣确定在同一位置是否存在两个(或更多)荧光团，则对除一个荧光团外的每个荧光团进行控制是有用的，依次排除每个候选的共定位。例如，如果你用AlexaFluor 488染色蛋白A，用AlexaFluor 546染色蛋白B，这些蛋白是在同一细胞位置的候选蛋白，包括两个对照:一种是不染色蛋白A，另一种是不染色蛋白b。即使你使用的荧光团在光谱上分离得很好，一个通道的荧光总是会渗入另一个通道，特别是在一个通道中蛋白质含量高得多的情况下(例如:通过病毒结构过度表达)或一个荧光团比另一个强得多。按照上面的例子，如果你已经对蛋白质a和B进行了染色，那么在不进行B染色的情况下观察B通道，我们就会知道通道B中有多少信号是由于通道a的渗出造成的。如果你想对蛋白质a和B之间的空间重叠程度做出任何陈述，这种类型的信息将是必不可少的。
如何生长/安装细胞和组织
幻灯片和盖子
确保使用#1.5的盖子(平均厚度0.17mm)。这就是我们显微镜上几乎所有物镜的设计目的;其他厚度将导致明显较差的图像，特别是使用高分辨率物镜。如果您没有使用#1.5盖，这是您可以做的最便宜的事情之一，以改善样品在显微镜下的外观。
在盖盖/样品界面处，光学性能将是最佳的。因此，如果适用的话，尝试在盖层(而不是载玻片)上培养细胞。
使用一个盖盖，不要一直延伸到幻灯片的边缘。大的盖子支撑着载玻片的一个边缘，导致倒置显微镜上的图像在z维度上倾斜(MSL的所有共聚焦镜都是倒置的)。此外，它们很难用指甲油正确密封，这可能会导致各种问题(见下文)。
菜
如果你想在培养皿中培养细胞，为了获得最佳效果，使用1.5号玻璃盖底部的培养皿。MatTek和ibidi就是销售这些产品的公司的例子。如果你的细胞在玻璃上生长有困难，可以使用涂有各种物质的盖子。另外，一些由ibidi制作的盘子有专有的塑料底部，光学上类似于1.5号玻璃盖子，某些细胞类型的粘附性比玻璃更好。
载玻片或玻璃罩
如果您使用的是室内盖玻璃支架(如Nunc Lab-Tek II)，请确保盖玻璃为1.5号。如果你用的是腔玻片，记得在最后用#1.5盖片。请注意，腔室幻灯片的便利性带来了两个问题:
- 因为细胞是在载玻片上生长的，当腔室被移除时，在孔周围留下了间隔物，所以细胞在染色和安装后可以离盖盖相当远。因此，光学性能不是最佳的(见上文)。在某些情况下，与覆盖玻璃的距离可能非常大，以至于超过了一些高分辨率物镜的工作距离。
- 因为细胞的腔室占据了载玻片的大部分，所以你需要大的盖片，一直延伸到载玻片的边缘。因此，这可能导致样品在倒置显微镜中倾斜(就像我们的两个共聚焦显微镜一样)，以及使样品难以密封(因为盖盖边缘和载玻片边缘之间的空间很小)。
多井盘子
如果你想要高分辨率(例如，亚细胞结构)，使用#1.5覆盖玻璃底部的板。如果您不介意牺牲一些分辨率，以方便塑料底多孔板，您将只能使用某些低分辨率物镜(低放大倍率，仅限空气)。如果您决定使用板，请联系MSL工作人员以获得进一步的指导。
荧光团
较新的荧光团往往比旧的更亮，更稳定(例如，AlexaFluor 488比FITC更好)。
用于流式细胞术的染料(PE, APC)由于其广泛的激发光谱而不是显微镜的最佳选择。
请记住，在光谱的蓝绿色区域有更多的自身荧光。如果你的组织有很强的自身荧光，用红色或远红色染色可能是有利的。
如果染色罕见的结构或蛋白质，需要在你的样品中找到大量的追查，避免远红色染料(如AlexaFluor 647)。远红色染料是肉眼看不见的。因此，你需要使用显微镜探测器找到你感兴趣的结构，它的视野更小，刷新率更慢，动态范围比人脑组合更低。这将使它更难和更慢地找到你正在寻找的特定的东西。因此，对于这些情况，最好用可见荧光团标记那些罕见的结构。
请MSL的工作人员帮助决定染料和荧光蛋白之前开始你的实验。从长远来看，这可以为你节省很多时间和金钱。
越来越多的媒体
如果可能的话(当使用盖盖和滑梯时)，使用安装介质减少白化。我们的用户已经取得了良好的效果与延长黄金，延长钻石，Vectashield和Fluoromount等。避免安装带有DAPI的介质。相反，单独染色DAPI。在安装介质中使用DAPI会导致明显更高的背景(特别是在宽视场显微镜中)和DAPI染色的问题。请注意,延长金不适合用于荧光蛋白(即GFP, RFP等)， vectasshield不适合AlexaFluor 647．
安装介质通常采用硬化或非硬化配方。第一种方法倾向于将荧光保存更长时间，并在样品变硬时使其变平。如果您对样品的详细3D特征不感兴趣，这通常不是问题，并且使样品更薄，更容易在宽视场显微镜上可视化。如果你确实关心细胞或亚细胞成分在三维空间中的排列，不要使用硬化介质，或者不要让硬化介质真正硬化。为了保留样品中的3D信息，在加入安装介质后立即穿上盖板，擦去多余的安装，并用指甲油密封。在将样品带到MSL之前，给你的指甲油一段时间硬化(即，在下来之前不要密封它们5分钟)。如果盖子松动，这可能会导致安装介质沉积在物镜上，使其难以成像样品，甚至损坏物镜。
不要在开口的容器中使用安装介质，如多孔板、盘子或室盖玻璃;你将需要相当大量的试剂，这使得它非常昂贵。只需将样品保存在缓冲液(如PBS)中，在黑暗中保持4摄氏度，直到成像。
光学显微镜样品制备服务
校园里有几个很好的核心可以帮助你准备样品: